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          基爾頓生物科技 JRDUN BIOTECHNOLOGY
          思想留給科學
          實驗服務
          產品名稱:

          免疫熒光

          上市日期:2014-10-30

          一、服務介紹

          免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體反應的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標本,熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色),可以看見熒光所在的細胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質、定位,以及利用定量技術測定含量。

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          二、實驗原理

          將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體(或抗原)上,與其相應的抗原(或抗體)結合后,在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。

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          三、實驗流程

          免疫熒光單標記方法

          免疫熒光單標記是指只標記一種蛋白質分子,方法比較簡單,只要按照染色步驟去做,通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇,固定液選擇的合適與否,可能會直接影響染色結果。具體染色方法如下。

          1、所需材料與試劑

          a, 培養在蓋玻片或玻璃培養皿中融合程度達到60%-70%的細胞。

          b, 一抗、FITC或TRITC標記的二抗。

          c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預冷20 min)。

          d, 封閉液。

          e, 0.01mol/LPBS緩沖液。

          2、染色方法

          a, 取出培養有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養皿,用0.01MPBS洗2-3遍。

          b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

          c, 加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

          d,正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min,抑制IgG的非特異性結合。阻斷血清選擇與二抗同一種屬的正常血清。

          e, 去掉正常血清,直接加入一抗,37℃孵育1 h或4℃過夜??贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經試驗而定)。

          f, 0.3% TritonX-100洗5 min,0.01 mol/IPBS洗5 min,0.3% TritonX 5 min,0.01 M PBS洗5 rain。

          g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗,37℃,孵育1h。

          h, 0.3%TritonX-100洗5rain,0.01 mol/LPBS洗5min,0.3% Triton X 5min,0.01mol/LPBS洗5 min,用濾紙吸干。

          i, 90%甘油(PBS配制)封片。

          j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察,或于4℃避光保存。

          免疫熒光雙標記方法

          免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內兩種蛋白質分子,當懷疑某種配體與已知受體結合后可用此方法加以證明。此方法稍微復雜一些,應注意所用的一抗是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如:A抗體為多克隆抗體,來自家兔;B抗體為單克隆抗體,來自小鼠)。其次,兩種二抗所帶熒光素的發射光不應重疊,且盡量遠離,通??梢赃x擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5,或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下,染色時兩種一抗可以同時孵育,然后可以同時孵育兩種二抗。但當染色結果一種顏色非常弱,而另一種顏色比較強時,應考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標記。

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          四、客戶提供

          細胞株或細胞爬片。注:細胞爬片不宜太密;細胞固定。組織切片,一抗

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          五、公司提供

          基本實驗步驟、藥品、樣品處理、圖片及圖片分析,熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝

          實驗周期:1-3周

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